这次分享的主题是便携式（小型化）、全集成（一体化）的核酸检测分析系统，本篇参考的文献是由清华大学程京院士团队所撰写的文献[1]。关于核酸检测小钱往期的文章分享过很多，以及微流控核酸检测的分享也不少，本篇参考的文章描述的很系统，小钱希望此次分享对分子检测领域朋友们起到纲举目张的学习效果。
新冠持续了三年之久，在2022年年尾的时候终于放开了，之后新冠检测的需求量出现断崖式的下跌，过去三年筛查个体或部分范围内是否存在新冠感染者的需求大，但是未来随着新冠恐慌心态减轻或消除后，筛查出是每个个体是由哪种呼吸道病原体所感染的意义更大，而市场的需求永远都是终端客户决定的，即依然需要一种快速准确的多重核酸诊断技术且落地成抗原检测卡一样的产品。而在儿童医院和急诊或重症监护等紧急的应用情景，未来呼吸道病原体的即时和高效的检测需求会更紧迫。便携式全集成核酸检测即我们通常说的分子POCT借助微流控技术，是最有望实现以上需求的技术手段，为满足床旁检测和现场即时核酸检测提供极大的可能，如我们已经熟知的赛沛GeneXpert和BioFire FilmArray，已经实现了对核酸的多重快速的检测。本篇的学习分享小钱将综述便携式全集成核酸检测系统所涉及的核酸生物检测技术，以及对往期小钱分享的分子检测文章做梳理，希望对同研究领域的小伙伴们有所帮助。
学习目录
1. 便携式核酸检测（微流控卡盒）的商业化背景
2. 便携式微流控卡盒涉及的生物技术
2.1 样品裂解
2.1.1 化学裂解
2.1.2 机械裂解
2.1.3 电裂解
2.1.4 热裂解
2.2 核酸提取纯化
2.2.1 液相提取
2.2.2 固相提取
2.3 核酸扩增
2.3.1 变温扩增
2.3.2 恒温扩增
2.3.3 数字扩增
2.4 扩增产物检测
2.4.1 光学检测
2.4.2 电化学检测
2.4.3 电子检测
2.4.4 纳米孔测序
3. 微流控卡盒之试剂存储技术
3.1 液体试剂存储
3.1 固体试剂存储
4. 微流控卡盒之成熟的驱动技术
4.1 泵阀控制
4.2 离心控制
4.3 微隔膜泵阀控制
4.4 薄膜挤压控制
4.5 电润湿控制
4.6 其他控制方式
5. 便携式核酸检测（分子POCT）技术挑战与展望
6. 小钱往期分子检测文章梳理
6.1 文章导图
6.2 文章推荐
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1 便携式核酸检测（微流控卡盒）的商业化背景
核酸检测已在众多领域普遍应用，其应用价值和重要意义不言而喻，如疾病的诊断与预后、公共卫生、食品安全、分子育种、法医鉴定等[1]。
实验室内标准的核酸检测主要包括３个步骤：样品预处理、核酸提取与纯化、核酸扩增和检测。需要专门的操作人员和物理分区空间，很多步骤尚需人工操作，因此面临操作繁琐、样品和试剂容易对操作人员造成危害以及核酸产物污染的风险。因而影响了核酸检测的普及程度。面对复杂的核酸检测流程，全集成自动化的核酸分析系统是解决上述难题的唯一出路，实现“样品进－结果出”的检测目标，这样能大大减少人员操作，降低样本和扩增产物的潜在污染危害，提高检测的可靠性，逐步实现高通量快速检测，最大程度的节约人力成本和减少空间占用。因此全集成核酸分析系统成为近年来国内外研究和产业关注的重点。
目前已经推出了许多全集成核酸分析平台产品，但各平台不仅采用的技术方案存在差异，在适用范围上也有很大差别。依据应用场景全集成核酸分析系统主要分为两大类，第一类是面向医学检验机构的高通量样品检测需求的全自动核酸检测工作站， 代表性的产品有罗氏 （ Ｒｏｃｈｅ） 公司Ｃｏｂａｓ ６８００ ／ ８８００ 系统；第二类是面向现场即时诊断的便携式全集成核酸分析设备，代表性的产品有赛沛（Ｃｅｐｈｅｉｄ）公司的 ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ 系统。
即时诊断的便携式全集成核酸分析设备优势在于：无需将样品带回中心实验室，实现现场检测，使用方便快捷；全封闭的自动化处理过程，减少人为干预，操作简便，省时省力，保护操作人员自身安全，对环境的污染小。面对当前我国应对疫情的策略，将会发挥巨大作用。
便携式全集成核酸分析的研发并非易事，其研制与搭建是一个复杂的系统工程，需要医学、生物、化学、工程、物理等多学科知识交叉，就系统而言主要涉及核酸检测生物技术和检测系统器件技术两个方面，同时各自又有若干可供选择的技术方案，通过排列组合能够形成多种全集成核酸分析系统技术路径。
图1 便携式全集成核酸分析系统技术路线
如图 １ 所示，体现了全集成核酸分析系统多学科交叉化和技术路径多样化的技术特点。
即时检测的便携式核酸分析系统及分子POCT产品，目前市场上几乎大部分商业化的分子POCT产品都是基于微流控芯片（卡盒）平台技术实现的，虽然有一些非微流控的分子POCT产品如优思达的EasyNAT® POCT，但是毕竟很少，对于研发分子POCT产品用微流控技术平台相对而言比非微流控技术平台要容易，且可学习的商业化案例也多些，对于做任何产品，微流控技术并不优越且研发还坎坷，只是微流控技术和分子检测的应用场景比较契合，比较容易满足将传统的PCR的分区集成且具备全密闭性。分子POCT产品不管什么技术平台，其实研发思路和技术原理是相通的，如果具备几年的微流控研发和工艺技术基础积累可以重点开发微流控的分子POCT产品项目。
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2 便携式微流控卡盒涉及的生物技术
核酸靶标的检测通常需要样品裂解、核酸提取纯化、核酸扩增和扩增产物分析这几个步骤。样品裂解保证了在细胞、细菌或病毒内的核酸释放。核酸提取纯化确保了核酸的纯度和含量，为下游的核酸扩增奠定基础。核酸扩增可以显著提高核酸目的片段的浓度，从而提供现有检测设备可检出的产物信号。扩增产物分析是为获取扩增产物所包含的信息。当面对具体的核酸检测需求时，对样品裂解、核酸提取和扩增检测方法的合理选择与组合，需要统筹考虑众多因素，如样品类型、样品体积、待分析核酸的来源（人的细胞、细菌、病毒等）、脱氧核糖核酸ＤＮＡ或是核糖核酸ＲＮＡ分析、检测灵敏度、检测靶标数目等。没有一种单一固定的方法可以适用所有类型样品的核酸检测。下面将分别针对核酸检测的每步操作介绍现有的技术方法。
2.1 样品裂解
样品裂解是核酸分析的第一步。破坏包裹在核酸外的细胞膜或细胞壁，释放核酸的方法主要包括化学裂解、机械裂解、电裂解和热裂解等方式。
2.1.1 化学裂解
化学裂解是一类常用的细胞裂解方法，它依据裂解样品和细胞的类型而选择对应的化学物质，例如用高离液盐、碱溶液、表面活性剂、蛋白酶Ｋ、溶菌酶等，来溶解破坏细胞膜或细菌壁。化学裂解操作简单、条件温和，不需要复杂的配套仪器，但是在后续的核酸提取过程中往往需要清除裂解液中抑制扩增的物质。
2.1.2 机械裂解
机械裂解是利用机械作用力（剪切力、震荡力、研磨力等），对细胞结构的直接破坏来释放细胞内物质的方法。超声破胞、微珠研磨等都属于机械裂解释放核酸的有效方法，其特点是效率较高、速度快，能非特异性地裂解所有细菌细胞且可不引入影响后续扩增的化学试剂，免除了后续清除的麻烦，尤其对于难以破胞的细菌、真菌更是最佳的选择。机械裂解需要借助外部仪器设备来实现。
2.1.3 电裂解
电裂解是指利用高强度电场使细胞膜表面产生不可逆孔洞，从而释放胞内物质的方法。当外界电场施加在细胞上，细胞膜会产生跨膜电压，当该电压超过一定的阈值时，细胞膜就会产生不可逆的损坏，导致细胞的裂解。宏观尺度的电裂解需要在样品中直接施加高电压，微观尺度的电裂解需要借助微电极产生的电场作用于细胞上。
2.1.4 热裂解
热裂解是通过反复冻融细胞，在细胞膜上形成冰晶，破坏细胞膜从而释放胞内核酸的裂解方式。这种方法比较耗时，操作繁琐。热裂解的另一种方式是利用高温（９０℃～１００℃）使细胞壁或者细胞膜的蛋白变性，从而破坏细胞。长时间的高温会破坏细胞内的蛋白、酶、ＲＮＡ等，因而限制了热裂解方法的应用。
2.2 核酸提取纯化
核酸的提取与纯化是为了保证样品中的核酸完整性与纯度，使后续的核酸扩增反应可以顺利进行。核酸提取方法大致可分为液相提取与固相提取。
2.2.1 液相提取
液相提取主要有苯酚－氯仿法。苯酚氯仿与样品经过激烈的混合和离心后，生物样品中的蛋白质被苯酚氯仿变性并被萃取到下层的有机相而核酸分子则被保留在上层的水相中。该方法由于使用了有毒挥发性有机试剂，对实验者健康有较大影响，因而已逐渐被其他核酸提取方法所取代。
2.2.2 固相提取
固相提取按照原理分类主要有３种技术方法：凝胶过滤、基于电荷可逆吸附的离子交换色谱法和基于可逆表面吸附的亲和色谱法。这些方法都能与离心柱或色谱柱结合，后两种方法还能够结合到微珠表面。
基于可逆表面吸附的亲和色谱法的原理：在高离液盐或高浓度醇的酸性环境中，带负电核酸分子与带负电硅基表面会因高离子强度和氢键而吸附结合；当去除高离液盐或是醇的环境后，核酸会被释放。该方法用于核酸提取通常分为四步：裂解、结合、清洗和洗脱。亲和色谱法无需使用有毒试剂，对实验操作人员的伤害少，且操作简单、用时短。
其中基于磁珠法的核酸提取是目前最常用的核酸提取方法，在磁珠表面修饰可以吸附核酸的特定官能团，通过不同的溶液环境以及外界磁场作用，达到裂解、结合、洗涤和洗脱的目的。该方法容易实现自动化、高通量的操作。
2.3 核酸扩增
待检测样品中的核酸物质含量通常较低，只有通过核酸扩增才能达到被特异性检出的水平。核酸扩增技术根据工作温度的不同可分为变温扩增、等温扩增。此外，近年来有别于单一腔体中的扩增技术，数字扩增技术备受亲睐。
2.3.1 变温扩增
变温扩增技术主要是指聚合酶链式反应ＰＣＲ，其在分子生物学中应用最为广泛，是核酸检测最常用的方法。ＰＣＲ主要利用３个温度对核酸分子进行变性（９５℃）、退火（５５℃～６５℃）和延伸（７２℃）。在变性阶段，双链ＤＮＡ分子变成单链；在退火阶段，引物与单链ＤＮＡ的互补序列结合形成双链；在延伸阶段，ＤＮＡ聚合酶催化形成新的ＤＮＡ双链，周而复始，重复循环，即可得到指数扩增的核酸。根据循环次数、仪器的升降温速率性能，ＰＣＲ反应一般耗时１至数小时。虽然ＰＣＲ以其高灵敏性和特异性在核酸检测中得到了广泛应用，但其对温度循环的依赖，导致配套控制仪器体积大、成本高，限制了其在即时检测中的应用。
2.3.2 恒温扩增
恒温扩增技术利用生物体的DNA或RNA合成酶，无需温度循环即可实现核酸的扩增，如环介导等温扩增LAMP、重组酶聚合酶扩增RPA、滚环扩增RCA、解旋酶依赖扩增HDA、核酸序列依赖扩增ＮASBA等。恒温扩增技术的出现，降低了核酸扩增对精确温控设备的需求，使得便携式核酸检测设备的发展成为可能。
2.3.3 数字扩增
数字扩增技术与传统的核酸扩增技术都是对待检测核酸进行扩增，但二者的区别在于：数字扩增是将核酸样品分散到成千上万个独立隔绝的空间中进行大规模的平行核酸扩增反应，然后含有目标核酸片段的微反应空间会经扩增得到荧光信号，最终通过直接计数或泊松分布公式即可对原始样本的核酸数进行计算。数字扩增相对于传统扩增方法，其准确度更高，可以实现真正意义上的绝对定量，具备分析单个核酸分子的能力。数字扩增有数字ＰＣＲ扩增技术ｄＰＣＲ和一系列的数字等温核酸扩增技术，如数字环介导等温扩增技术ｄＬＡＭＰ、数字重组酶扩增技术ｄＲＰＡ、数字等温滚环扩增ｄＲＣＡ等。
2.4 扩增产物检测
在核酸扩增过程中或完成扩增后，检测扩增产物的量是获取靶标核酸信息的重要步骤。常见的核酸信号检测技术有光学检测、电化学检测、电子检测与纳米孔测序。可以根据实验或者诊断的需求选择合适的产物分析技术，从而完成核酸检测。
2.4.1 光学检测
光学检测核酸通常通过检测结合在靶标核酸上的光学探针来实现，典型的光信号包括吸光度、荧光信号、光反射和等离子体共振。操作人员可以使用肉眼、荧光检测仪、酶标仪、显微镜或是智能手机等，在离心管、孔板、试纸条、微流控芯片等平台上检测这些光信号。其中荧光信号检测是最为常用的核酸检测方法，荧光探针可以和双链核酸非特异性结合或是和对应的核酸单链互补结合进而产生荧光信号。使用荧光基团与淬灭基团结合的探针能够保证更高的特异性与灵敏度。近些年，逐渐兴起的基于规律间隔成簇短回文重复序列ＣＲＩＳＰＲ及关联核酸酶Ｃａｓ的核酸检测技术，其中Ｃａｓ蛋白被用作高度特异性的序列识别元件，与靶标核酸结合后切断荧光淬灭基团之间的化学键，产生荧光信号。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技术与等温扩增技术结合，可以实现检测传感器的小型化，应用于现场即时诊断。此外，基于比色法的可视化检测也是即时诊断的重要发展方向，其对仪器的检测系统要求较低，甚至可以肉眼判断最终结果。为了提高光学检测的灵敏度，用金属纳米颗粒，如纳米金或纳米银，去修饰检测基底或靶标分子，实现表面等离子体共振ＳＰＲ或表面增强拉曼反射ＳＥＲＳ可以被用来增强信号强度。传统的凝胶电泳成像也是对核酸扩增产物进行可视化检测的方法，但该方法需要制备凝胶，操作繁琐，耗时长，只适用于实验室检测。
2.4.2 电化学检测
电化学检测也是常用的核酸检测方法，其能够在微纳尺度的平台上实现核酸非标记、高灵敏和高特异性的检测。典型的电化学核酸传感器包含３个接触电极，分别是表面修饰了捕获核酸探针的工作电极ＷＥ、对电极ＣＥ和参考电极ＲＥ。通过检测３个电极之间电流、电势和阻抗的变化，来判断是否有靶标核酸。
2.4.3 电子检测
电子检测核酸是利用半导体材料与生物大分子结合具有灵敏的响应特性，通常以场效应晶体管ＦＥＴｓ形式实现检测。与电化学传感器类似，在检测核酸的场效应管设计中，负责捕获的核酸探针固定在ＦＥＴ表面，当靶标核酸与固定的探针杂交结合后，就会产生电流或电压信号的变化。硅纳米线、碳纳米管、石墨烯等常被用来制作电子传感器，其检测灵敏度非常高，甚至可以实现无需扩增的靶标核酸检测。
2.4.4 纳米孔测序
基于纳米孔的基因测序是下一代基因测序技术的基础。纳米孔测序的工作原理是当单链的ＤＮＡ或ＲＮＡ穿过电场驱动的纳米孔时，读取电流的波动，进而采用算法将信号转换为碱基识别的序列数据。迄今为止，用于ＤＮＡ测序最有效的纳米孔是通过自组装蛋白质或肽制成的，而由固态材料和二维纳米材料（例如石墨烯和二硫化钼）制成的纳米孔也在进一步研究中。英国牛津纳米孔科技公司的纳米孔测序仪可以提供掌上便携的、实时、长读长的直接测序，性能强大，但其成熟度还需考察，目前并未大量应用于分子诊断领域。
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3 微流控卡盒之试剂存储技术
便携式全集成核酸分析系统需要微型化、集成化与自动化地实现不同需求的核酸检测全流程，因此又具有高度集成化与功能拓展化的技术特点。该系统的构建主要涉及反应试剂存储技术、微流控技术和光机电软件一体化仪器技术。其中，前两项为便携式全集成核酸检测的关键核心技术。
传统的微流控芯片需要通过外接的泵阀和复杂的宏观与微观的微流道接口，将外界的反应液体注入芯片进行反应，该过程需要多步人工操作，难以将反应液体集成到芯片上，实现反应液在芯片上的可控存储与释放。这一方面是受限于芯片设计与加工工艺，另一方面是试剂长期保存本身就有难度。因而，传统的微流控芯片系统只能适应实验室的研究，难以适用于现场的即时诊断。随着在芯片上试剂存储技术的不断发展成熟，便携式的全集成核酸分析系统也逐渐从实验室走向了应用现场。应用于核酸检测分析的试剂类型有多种类型，如反应酶、引物、底物和缓冲溶液等，不同的试剂类型需要根据自身性质选择不同的存储条件。例如，储存蛋白类试剂就对温度、溶液ｐＨ值敏感；荧光探针或光激发材料就需要避光存储；纳米颗粒需要存储在特定盐浓度和表面活性剂的溶液体系中保持良好的悬浮分散性；如琼脂糖类似的凝胶存储就需要保持湿度，以保持其孔隙形态等等。此外，集成到微流控芯片中的试剂的体积用量的跨度极大，需求情况复杂，如液体试剂的体积范围可能从皮升到几百微升，固体试剂的质量从皮克到微克量级。总体来说，便携式全集成核酸分析系统理论上需要稳定储存所有反应所需的液态和固态试剂，并可实现试剂的可控释放与反应，进而方便用户操作，实现“样品进－结果出”的目标。
3.1 液体试剂存储
液体试剂存储按其存储位置可分为在芯片内部和外部两大类。第一类是存储在微流控芯片之外的液体试剂，芯片通过细导管或是储液管接口与外界储液管相连，使用时通过外部控制设备将试剂注入或导入芯片进行反应。这种方法的缺点是需要外界的导管、泵阀、流路、控制单元，增加了泄漏、污染、产生气泡的风险，以及无法避免管道接口中的死体积。第二类是存储在微流控芯片之内，通过主动控制释放的方法，使试剂进入芯片反应腔参与反应。具体分为：使用铝箔、塑料或玻璃的泡罩密封存储试剂，使用时通过挤压、刺破等施加外力方式破坏密封释放试剂；使用石蜡、水凝胶、可被电热溶解的薄膜或是单面胶密封芯片上的储液腔出口，使用时局部加热融化石蜡、或加热使水凝胶脱水、或通电融化薄膜、或顶开单面胶密封阀，最终释放被存储的液体。
3.2 固体试剂存储
固体试剂存储方法按固定位置也分为两类。第一类是先将试剂固定在载体上，之后将载体集成到微流控芯片之内；第二类是直接在微流控芯片内固定试剂。第一类方法最常用的载体是微珠。微珠的材料有多种选择，如：多聚物、玻璃、金属、凝胶等，其尺寸结构可以从纳米级别跨度到毫米水平。微珠材料既可以通过被动吸附方式固定试剂，也能够通过化学反应交联试剂。微珠比表面积大，与平整芯片表面比，能够有效固定更多试剂，反应效率也更高。此外，将试剂固定在微珠上，能够将试剂的固定与试剂在芯片上存储集成这两步操作分步优化，因此简化了质控，使得芯片装配与应用更加灵活。第二类方法是在芯片内直接固定试剂。固定方式分为两种。一种是将试剂通过冻干、真空干燥或多孔介质吸附干燥等方式进行脱水处理，在反应腔内加入固体形态的试剂。使用时，用缓冲液复溶后进行后续的反应。另一种是利用非接触式喷样、接触式点样、微接触式印刷、浸蘸笔纳米加工等方式图案化固定反应试剂于微流控芯片内的反应基底上，如玻璃、硅片、电极等。使用时，待检测分子与图案化固定的试剂进行结合反应，产生光学、电学、化学等信号。
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4 微流控卡盒之成熟的驱动技术
微流控技术是一种能够在微升纳升级别精确操控液体的技术，其在生物化学分析、化学合成、生物医学检测等领域有着广泛的创新与应用。正是由于微流控技术的应用，才使得整个核酸检测流程能够集成到一张芯片上完成，因而才有可能实现便携式全集成核酸分析系统的研发。下面章节将介绍不同微流体控制类型的代表性全集成核酸分析系统。
4.1 泵阀控制
美国赛沛公司的产品ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ系统是最早商品化的全集成核酸分析系统。ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ的反应卡盒内包含了一个一体化的活塞泵旋转阀组合件、反应液存储腔以及集成了反应所需的全部试剂、ＰＣＲ反应腔、底座和密封盖。其中一体化的活塞泵旋转阀组合件能够旋转选通各个反应液存储腔，并通过抽拉中央的活塞泵进行液体的转移，是整个卡盒微流体控制的核心部件。使用者只需将液体样品加入反应卡盒，之后反应卡盒配套的控制仪器便能自动完成样品超声裂解、样品制备、ＰＣＲ扩增、实时荧光检测并输出分析结果，整体分析时长４５分钟，如图２所示。但ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ只有一个ＰＣＲ反应腔，单次反应检测的指标数量有限，限制了其更广泛的应用。
图２ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ系统。（ａ）ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ卡盒结构爆炸图，红色箭头表示中央活塞泵驱动方向；（ｂ）ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ卡盒实物图；（ｃ）配套控制仪器
4.2 离心控制
德国弗莱堡大学的Ｓｔｕｍｐｆ等将核酸分析的步骤集成在名为ＬａｂＤｉｓｋ的离心式微流控芯片上，将裂解溶液、洗液、洗脱液等存储于铝袋中，而引物、探针等固定于反应孔中。实验时，靠程序化控制芯片的旋转速度、加速度和方向，依次实现铝袋中的试剂释放、基于磁珠法核酸提取、洗脱液与扩增体系混合和反应液分配到多个反应腔中，之后进行ＰＣＲ温控循环并进行实时荧光检测，分析总时长３ｈ４５ｍｉｎ。该离心芯片无需集成复杂的泵阀，只需要靠离心力就能实现复杂流体的多步控制，结构简单，而且配套的控制仪器只需要电机即可控制芯片离心旋转，因而结构便携小巧，如图３所示。
图３ ＬａｂＤｉｓｋ离心式微流控系统。（ａ）离心式微流控芯片上的惯性力；（ｂ）芯片实物图；（ｃ）配套控制仪器
北京博奥晶典公司自主研发的全集成碟式芯片系统，将反应所需液体试剂存储在芯片的铝箔泡罩中，使用前挤压刺破泡罩释放试剂。该全集成碟式芯片使用时，同样通过离心力驱动实现多步流体的控制，能够在一张微流控芯片上实现基于硅基膜法的核酸提取、巢式等温扩增和实时荧光检测分析过程的全自动和全封闭操作。该仪器系统操作简单、结果准确、灵敏度高，每张芯片可检测两个样品，可在４５ｍｉｎ内完成实验，能很好地满足重大传染病现场的快速、无创检测，如图４所示。
图４ 全集成碟式芯片系统。（ａ）碟式芯片结构设计图；（ｂ）碟式芯片实物图；（ｃ）配套控制仪器
4.3 微隔膜泵阀控制
北京博晖创新公司的ＥｎｃｏｍｐａｓｓＭＤｘ微流控全自动核酸检测系统是将核酸提取和扩增的试剂存储设计在芯片外，系统工作时通过工作站的机械臂加入芯片。芯片上排布的微隔膜泵阀分别与仪器对应的气路密封相通，当外界抽真空时，微阀下吸被打开；当外界增加气压时，微阀上顶被关闭；当相邻的微阀依次打开关断就能形成微泵抽吸效果，转移定量液体。该芯片上能够完成细胞化学裂解、基于磁珠法的核酸提取、多重ＰＣＲ反应以及最后的微阵列杂交检测，整体控制流程可在５ｈ内完成。其核心的优点在于，将移液工作站和芯片结合，能一次处理多份样本，如图５所示。但该系统现有设计能处理的样本体积量较小，再加上其芯片上流体操控方式和化学裂解的局限性，限制了其难处理较为复杂样本的能力，如拭子、痰液等。
图５ ＥｎｃｏｍｐａｓｓＭＤｘ微流控系统。（ａ）芯片微泵微阀结构设计图；（ｂ）芯片实物图；（ｃ）配套控制仪器
4.4 薄膜挤压控制
法国梅里埃公司的ＦｉｌｍＡｒｒａｙ全集成核酸分析芯片分为两个部分，储液管组和柔性薄膜反应区，使用前只需将用于复溶试剂的水溶液和待检测样品加入储液管组，之后将芯片放入仪器，随后所有的流程由仪器自动化完成。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ芯片实现了完整的细胞微珠研磨裂解、基于磁珠法的核酸提取纯化、巢式ＰＣＲ扩增和荧光熔解曲线检测，总分析时长１ｈ。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ整个反应流程完全密闭，依靠外界施加力挤压薄膜实现流体的转移和腔体之间管道的密闭。其具有１０２个反应腔，理论上最多能够检测１０２个不同靶标，单个疾病种类检测套餐，如呼吸道感染、血液感染、胃肠道感染和脑膜炎感染，基本能够覆盖常见的病原体，具有很强的竞争力。该芯片优点非常明显，技术很先进，如图６所示。但因该芯片的薄膜式结构，因而只能固定处理２００μＬ液体样品，很难满足大体积样品处理的需求，且加入的样品需要提前完成液化预处理。
图６ ＦｉｌｍＡｒｒａｙ微流控系统。（ａ）ＦｉｌｍＡｒｒａｙ芯片功能分区设计图；（ｂ）芯片实物图；（ｃ）配套控制仪器
4.5 电润湿控制
美国ＧｅｎＭａｒｋ公司的ｅＰｌｅｘ全集成核酸分析系统是利用电润湿技术驱动流体实现核酸的检测分析。电润湿技术是指通过改变液滴与绝缘基板之间的电压，来改变液滴在基板上的润湿性，改变液滴的接触角，使液滴发生形变、位移的现象。ｅＰｌｅｘ卡盒上集成了反应所需的全部液体试剂，能够实现“样品进－结果出”的核酸检测全流程，包括，基于磁珠法的核酸提取、多重ＰＣＲ扩增和ＤＮＡ杂交的电化学检测，整个检测流程小于２ｈ。单个ｅＰｌｅｘ卡盒很小巧，配套仪器数量可以灵活拓展，最多能够同时检测２４个卡盒样品，如图７所示。但基于电润湿的卡盒制造工艺较为复杂，成本较高。
图７ ｅＰｌｅｘ微流控系统。（ａ）电润湿技术原理；（ｂ）芯片实物图；（ｃ）配套控制仪器
4.6 其他控制方式
前述的各种控制方案的设计思路均基于不同微流控技术直接操纵反应试剂的定量、混合、转移与分配。优思达公司另辟蹊径，仅用外部磁场操纵磁珠依次通过不同试剂存储区域实现全核酸检测流程，无需控制试剂转移，如图８所示。检测管设计：一体化的核酸检测管内设置了多个呈上下布置的分隔塞，且在每个分隔塞上设置了疏水层，隔离检测试剂管内的裂解液、清洗液和反应液，另外采用试剂玻璃化技术实现了试剂常温存储与运输。检测管使用流程：将样品加入裂解液中进行混匀和裂解，并利用磁珠对核酸进行吸附提取，然后利用外部磁性装置带动捕获了核酸的磁珠沿着检测试剂管内壁的磁珠通道依次穿过各个疏水层进入清洗液和反应液，实现磁珠的清洗和核酸的交叉引物恒温扩增（CPA），总分析时长８０ｍｉｎ。该检测试剂管设计巧妙，无需复杂的泵阀，操作流程简洁，生产工艺简单。不足之处在于单个检测管最多只能容纳两个反应腔同时扩增检测，难以满足多指标检测的应用需求。
图８ 优思达全集成核酸检测系统。（ａ）一体化核酸检测管实物图；（ｂ）配套控制仪器
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5 便携式核酸检测（分子POCT）技术挑战与展望
全集成核酸检测系统的设计要瞄准临床诊断或即时检验的需求，从检测样品类型、样品处理量、检测指标、检测灵敏度、分析时间等方面全面基于目标进行设计。研发过程中应根据核酸检测的需要，权衡各项技术特点，选择合适的样品预处理方法、核酸提取以及扩增检测方法，设计生物检测流程，优化生物反应体系，基于系统工程思维，自动化和智能化系统检测流程，实现“样品进－结果出”全流程的设计。综合考虑样品量取、顺序混合反应、分离纯化、核酸扩增和检测等各项功能集成到微流控芯片中的兼容和融合，优化设计配套的控制装置，实现全自动操纵。在全集成核酸检测系统产业化的过程中，需要全面保证系统所需要的检测试剂、微流控芯片生产加工、仪器系统核心零部件的稳定可靠。需要指出的是，上述全集成核酸分析系统的研制过程并非能够一蹴而就，而是需要一个闭环的研发系统，不断反馈并反复优化各个方面细节，在不断的打磨迭代中成型。
目前便携式全集成核酸分析系统及其相关技术的发展面临４个方面的挑战：
分子诊断发展迅速，相关需求日益复杂，具体表现为样品来源多样化、样品处理复杂化、分析灵敏度以及指标数因检测愈发差异化，因而单一固定的微流控芯片以及分析仪器的设计难以满足复杂多样的核酸检测需求；２）现场即时快速诊断的场景日益复杂且要求日益增高，因此仅将传统手工核酸提取与扩增检测的流程由分析仪器实现自动化操纵，尚难以满足多样化核酸快速检测分析的需求，亟待核酸检测方法与微流控芯片设计协同创新；３）核酸检测对全自动化、便捷化的需求不断增加，无需专业人士参与的“样品进－结果出”式便捷操作将成为发展的方向；４）在满足上述要求的基础上，低成本制造便携式全集成核酸分析系统是产业发展的方向，尤其是其核心的微流控芯片的生产工艺要相对简单，成品率高，成本低，才有望大规模生产并广泛推广应用。
未来便携式全集成核酸分析系统及其相关技术可呈现４个发展方向：
１）模块化：为满足多样化核酸分析的需要，针对不同的样品预处理、核酸提取以及扩增检测模式，开发相应的标准化芯片以及控制仪器模块，再利用通用型接口，完成不同模块的灵活组合，满足相应的多样化需要；２）快速化：借助微流控芯片技术反应效率高和可自动化操纵的优势，引入相应的核酸快速检测体系，以实现靶标核酸的快速分析；３）集成化：集相关产业发展的优势，推动全集成核酸分析系统在模块化、小型化、自动化、多功能和智能化方向的发展；４）低成本：降低成本是推动产品应用和产业发展的动力，大力促进全集成核酸分析系统降低成本、提高效率、高通量产出，这将使全集成核酸分析系统得到快速发展
