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免扩增CRISPR分子诊断技术的研究进展

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免扩增直接检测核酸靶标是无数分子诊断研发者的终级目标。自CRISPR-Cas体系的反式切割活性被发现以来，先后有HOLMES、SHERLOCK等方法已经成功开发出来用于分子靶标的检测。由于Cas蛋白的反式切割活性强度相对不是足够高，为了更高的灵敏度和检测速度，因此上述方法以及以此技术衍生的大部分技术体系均需要对目标核酸进行预扩增（常见的是PCR和恒等温扩增）。然而，扩增步骤的引入不仅增加了检测复杂度，还降低了CRISPR体系的优势，仅能体现出CRISPR在特异性方面的能力（恒等温扩增方面可有效补充），并且增加了气溶胶污染的风险。

因此，开发无扩增的CRISPR-Dx检测体系是最为热点的方向[1]，针对目前的研究成果，可将其分为以下大致三种策略：（1）减少反应体积以增加靶标浓度；（2）电化学生物传感器收集微弱信号；（3）级联放大或生化电路体系构建。

1. 微容量CRISPR-Dx系统

以往的研究已经充分证明，单个反应体系中靶标浓度是决定反式切割活性强度的首要因素。研究者们首先想到就是减小单个反应体系的体积来增加靶标浓度。借助数字PCR的概念，将靶标核酸和CRISPR-Cas13a反应试剂被富集到在微液滴反应器中，以此增加靶标核酸的局部浓度，与常规大体积反应体系相比，其检测限提高了1万倍[2]。而几乎使用同样策略的研究中，Cas12a也实现了高灵敏的免扩增检测能力[3]。同时，微液滴生成的方式也是有很多种的，借助微室阵列技术构建的微型反应池，其开发的SATORI系统，能够在5分钟内检测低至5fM核酸靶标的检测[4]。

图1. 减小单个反应体系的体积来增加靶标浓度[2]

2. 电化学生物传感器

如上述所说，CRIPSR-Dx的灵敏度取决于Cas反式切割活性。通常，反式切割的报告基因一般有两种，一种是由荧光和猝灭剂标记核酸，反应后由荧光读取仪收集。另一种是由生物素和羧基荧光素双标记核酸，通过层析流动试验（常说的试纸条）检测其反应。这两类方法均比较稳定和简便，但输出的有效信号较弱，背景噪音高，导至检测灵敏度无法保证。因此对于CRIPSR-Dx反应中检测噪音下微弱的信号收集成为较大的诉求。而电化学生物传感器表现出了明显的锲合度。

首先Cas反式切割活性可以和电化学生物传感器串联使用，以E-CRIPSR(基于CRISPR-Cas12a的电化学生物传感器)为例，经过亚甲基蓝(MB)修饰的报告基因连接到三电极的传感器上，检测反式切割活性引发的微弱信号。在无需对靶标进行预扩增条件下，E-CRISPR可以在pM水平上成功检测HPV-16和PB-19[5]。借助此类技术路线，CRIPSR-Cas12a已经实现了100fM的登革热病毒的检测[6]。当报告基金更换为发夹DNA时，借助发夹DNA独特的形态结构，可以显著的提高灵敏度[7]。当发夹DNA作为反应中间的催化剂时，可以实现电极的重复利用，并显著的提高了检测效率(36min，50aM)[8]。此外，过往的研究已经证明，固态纳米孔生物传感器在单分子检测上表现出良好的性能和潜力，经过Cas蛋白反式切割后的报告基因片段可以被其捕捉，从而实现免扩增的核酸检测[9]，但是目前其检测限还无法满足需求。

图2. E-CRIPSR电化学传感器的基本原理[5]

图3. 发夹DNA在电化学传感器中的应用原理[7]

随着微流控技术发展的日趋成熟，电化学传感器和微流控芯片组合构建的检测器件已经多种多样。例如，将CRIPSR-Dx、电化学和微流控技术整合起来的核酸检测体系，可以对miRNA进行免扩增直检。其基本原理是也是基于CRISPR-Cas13的反式切割活性剪切报告基因，从而引发固定化报告基因一端耦联的GOx（葡萄糖氧化酶）催化H2O2的变化，进而被电化学传感检测[10]，最为独特的是此体系可以实现并联排布，从而达到多重检测的目的[11]。

Cas蛋白的顺式切割活性在基因编辑领域的应用已经非常普遍，其在核酸检测领域的应用也有诸多报道。例如，一种CRISPR-Dx体系，其仅利用Cas蛋白介导的特异性结合和顺式切割，通过电化学检测靶标基因的变化。信号探针首先与靶标核酸退火，形成后续Cas9-或Cas12a介导的顺式切割的双链DNA，从探针中去除电化学标签，并诱导明显的信号变化完成诊断[12]。另外，利用顺式切割能力突变后的Cas9（dCas9）和石墨烯场效应晶体管结合构建获得的CRISPR-Chip平台，可以实现在15min内检测1.7fM的靶标[13]。并且在后续迭代的体系中，实现了单核苷酸的检测[14]。同时，借助荧光原位杂交(FISH)技术原理，对dCas9和靶标核酸在内的三元复合物进行染色的策略，在检测金黄色葡萄球菌等病原体方面体系出了简单、精确、快速的优势[15]。

图4. 基于dCas9的CRISPR-Chip的核酸检测原理[13

3. Cas介导的级联放大

级联放大的策略在常规核酸检测中的较为常见，同样在CRISPR-Dx体系中也非常有效。例如Cas13a和Cas12f(Cas14a)联合使用可组合为一种级联放大体系，Cas13a反式切割产物可以作为Cas12f的激活剂，并进一步触发Cas12f介导的报告基因的反式切割，放大输出信号。利用此体系，其灵敏度比单独使用Cas13a提高了1000倍，达到了1.33fM的检测限[16]。同样，将Cas13a和Csm6 RNA内切酶联合使用的级联放大策略也具有良好的效果，Cas13a被触发后反式切割一个预激活子序列，从而激活Csm6的内切酶活性，催化报告基因放大荧光信号[17]。

图5. Cas13a和Csm6 RNA内切酶联合使用的级联放大策略原理[17]

而最近，借助两种crRNA序列和Cas12a组成的生化回路构建的CONAN体系在免扩增检测方面更近了一步。其基本原理是两个crRNA序列，分别与目标核酸和一个辅助探针配对。辅助crRNA被报告基因阻断，一旦报告基因被Cas12a反式切割，辅助crRNA就可以释放，进一步引导Cas12a反式切割更多的报告基因，从而实现信号的快速放大[18]。此外，将一个目标核酸序列的多个位点的特异性crRNA联合使用，也可以提高检测灵敏度[19]。

当然，除了上述三类策略外，还有诸多方法在免扩增检测上做出了努力。例如，借助金属增强荧光原理，将报告基金被切断后荧光信号通过Au纳米粒子二次放大，实现对靶标核酸的高灵敏检测[20]。以及借助电化学发光背景信号低的优点建立的免扩增CRISPR-Dx，也可以实现fM靶标核酸的检测[21]。

总结和展望

到目前为止，免扩增的CRISPR-Dx体系已经建立和发展了很多种，但是还没有一种足够满足现在诸多需求的产品。靶标微量化检测步骤复杂，电化学传感器的重现性一直都是业界的难题，比较而言针对CRISPR体系的级联放大策略小编认为是最有价值的方向。

参考文献

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