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数字PCR是一种核酸分子的绝对定量技术。相较于测序和定量PCR技术,数字PCR拥有更高的灵敏度,可以检测到极低浓度的样本,并实现精准的绝对定量分析,在感染性疾病、肿瘤个体化诊疗等多个重要疾病领域展现出广阔的应用前景。
对,就是下面的这两个大家伙!!!左边罗氏,右边赛默飞,从颜色上来看,也是形成了犄角之势。
参数比对
公司 | 罗氏诊断 | 赛默飞 |
产品名 | Digital LightCycler数字PCR系统 | Applied Biosystems™ QuantStudio™ Absolute Q™数字PCR系统。 |
检测通道 | 6色荧光检测通道以及1通道的参比通道 | 5色荧光通道检测 |
纳米孔板类型 | 3种(通用\高灵敏度\高分辨率) | MAP16微流体阵列式芯片板 |
单板通量 | 8个样本/板 | 16个芯片/板 |
最大通量 | 96个样本/次,12块/次 | 每次检测4个、8个、12个或16个样本。 |
检测时间 | 1.5小时 | |
操作步骤 | 需要核酸提取仪、数字PCR样本分区仪和数字PCR分析仪配合使用 | 全自动一体机,一台机器完成液滴制备、PCR 扩增、荧光信号收集,数据分析。 |
此外,该系统还具备绝对定量、插入或缺失、拷贝数变异等多种分析模式,可通过实验室信息系统(LIS)对样本进行信息自动化溯源,具有操作简便、通量高、速度快、通道全等性能和优势。
Applied Biosystems™ QuantStudio™ Absolute Q™数字PCR系统采用具有专利的微流体阵列式芯片技术。相比于其他数字PCR平台,该系统可在20480个固定纳米级微孔中生成95%以上的有效反应液滴,具有更少的死体积,且ROX通道具有质控功能,非正常液滴予以排除分析;PCR扩增前后信号采集,自动排除假阳性。配备3个LED光源,最多支持5个荧光检测通道(工厂校正),每份样本中可进行多靶标检测。
数字PCR是将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元(nL,纳升级别)中,使得每个反应单元中尽可能含有1个模板分子,并在此基础上进行扩增、检测和分布统计,从而实现靶标分子的绝对计数。
根据微反应单元的不同形式,数字PCR产品可分为微板式、微滴式和芯片式等。目前,市场上主要的数字PCR产品主要是基于微滴式和芯片式等。
与第一、二代PCR技术相比,数字PCR具有很多优势:
一是特异性、灵敏性均有显著提高;
二是在不依赖内参和标准曲线的前提下,可直接得到绝对量化指标;
三是微反应单元相互独立、封闭,避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰,准确度和可重复性较高。
数字PCR产品的发展,为不同场景下的多样化核酸检测需求提供了新的思路,尤其是在医学检验方面,在感染性疾病早期检测、癌症的液体活检、无创产前检查等领域展现出良好的应用前景。
◆ 实现感染性疾病早期高效检测
一是病毒检测。第二代荧光定量PCR检测技术是目前新冠病毒检测的“金标准”,但由于病毒探针结合位点突变、样本病毒载量不足等原因,在临床检测过程中经常出现假阴性结果,由于数字PCR具有更高的灵敏度、精准度,以及其适合痕量样本检测的特性,能够检测出荧光定量PCR检测过程中错过的感染,可作为后者的补充。
二是临床样本病毒载量评估。在人群筛查及临床诊疗中,为科学选取采样方式,需要评估不同临床样本病毒载量,如鼻咽拭子、血尿、粪便、肺泡灌洗液等,由于数字PCR可提供绝对量化指标,为采样方法的选取提供了参考,从而提高检出率。
三是监测环境病毒载量。数字PCR可对低核酸丰度样本进行有效检测,包括从不同环境中取样的样本,如病房、医院卫生间、实验室等等,在疫情防控中起到了不可忽视的作用。此外,数字PCR的应用场景还有病程不同阶段的病毒载量评估、核酸参考品制备、抗病毒药物研发等环节。
◆ 助力癌症液体活检,实现患者全病程监控
液体活检是普通癌症检测的延伸和补充方法,将目标采取样本从组织延伸到血液、体液。数字PCR可精确检测转移到血液循环中的肿瘤细胞和DNA片段,提供基因突变情况等信息,动态监控患者病程的发展,从而为伴随诊断和个性化治疗提供可靠依据
◆ 高效筛查胎儿疾病,提高无创产检普及性和依从性
通过无创产前检查,针对胎儿染色体非整倍体异常、遗传性基因疾病等进行风险评估对于家庭幸福保障、减轻社会负担具有重要意义。目前,大多数商品化的无创产前检查产品都是基于二代测序的技术和平台,该方法检测周期长(1-2周出报告)、技术门槛高、检测费用高,阻碍了进一步广泛应用。数字PCR技术为该领域提供了一种新的解决方案。根据相关研究,基于数字PCR的无创产前检测技术有望实现准确、快速、简便的产前筛查。
除上述场景外,数字PCR技术还有望在二代测序文库质控和结果验证、环境及食品检测等领域,成为第一、二代PCR技术的重要补充手段。